骨组织工程技术瓶颈及其原因分析
【摘要】 组织工程骨的研究发展迅速，但仍存在许多问题。主要的瓶颈是培养的细胞在功能和行为上与体内的细胞有较大差异，组织工程骨的成骨能力存在缺陷，形成的组织工程骨与天然的生理骨仍有较大差距。可能的原因是细胞的培养微环境不够完善，没有实现组织工程骨的同步血管化和神经化，组织工程骨与骨膜复合体的构建目前仍缺乏研究。
【关键词】 骨组织工程； 血管化； 神经化
用组织工程学方法促进牙槽骨再生，以修复牙周疾病引起的牙周组织缺损是近年来的研究热点。骨组织工程是用少量的具有分化潜能的细胞，经体外培养扩增后用以修复大块骨组织缺损，同时依据缺损情况任意塑型，达到理想的形态修复，最终实现真正意义上的功能重建。但该项技术发展至今，沿着传统的思路来构建活体组织工程骨的研究遇到了挑战。下面就骨组织工程技术中存在的问题作为切入点，探讨其可能的原因，以探索骨组织工程技术研究的创新之路。
1 细胞培养
1.1 细胞培养存在的问题
培养的细胞在功能和行为上与体内的细胞有较大差异。主要表现为：1）培养的成骨细胞不能有组织地分泌胶原纤维和形成板层骨结构，不能以体内所见的方式沉积具有天然骨特征的骨矿
物[1]；2）从体内到体外时，细胞会发生行为变异与转型，即培养休克，这些培养细胞通常仅维持三代，表型漂移变得较明显[2]；3）长期培养的成骨细胞会丧失向骨面分泌骨基质的分泌极性，跨越细胞孔壁生长，阻碍支架内外代谢产物和营养物质的交换，造成组织在支架上的分布不均[3]；4）培养的骨髓基质干细胞逐渐失去增殖潜力[4]；5）随着培养时间的延长，细胞的生长速度放缓，从纺锤状变为较大的扁平形态，端粒长度下降，所有的迹象都显示出老龄化倾向，延长的体外扩增也影响骨髓基质干细胞的分化潜能[5]；6）培养的间充质干细胞存活率降低[6]。
1.2 问题的原因分析
影响培养细胞的因素除大家熟知的生物学微环境，如植入物的营养供给和诱导种子细胞增殖及定向分化的生物信息外，力学和电学因素也会对其造成影响。
1.2.1 力学微环境 成骨细胞、骨细胞等是力学敏感细胞。骨组织丧失重力负荷或肌肉收缩的刺激会使骨组织产生变形或微损害，骨代谢遭受破坏。研究发现，载荷首先使成骨细胞发生分化，进而诱导骨基质沉积。由于人体细胞是在机体提供的微动力学环境中生长的，在体外采用传统的细胞培养方式和条件很难满足立体组织器官的细胞生长要求，细胞经常发生去分化现象，失去正常的形态与功能。目前有关应力对分泌纤维的成分、分布与排列即组织形成的影响研究尚少，而这恰好是自身组织形成的必要前提。因此，研究模拟体内生理条件下组织生长的微动力学培养环境、应力与生长的关系对组织工程有着非常重要的意义。
1.2.2 电学微环境 骨组织亦有电生理特性，其代谢活动和机械形变能够产生直流电和交变电场，外来电场也可影响骨骼的生长与改建。外来电场的负极能诱导成骨细胞的形成与分化，可缩短骨不连、骨折患者的愈合时间。破骨细胞同样也受电磁场的影响。张加理等[7]发现，牙体硬组织表面电位可影响骨改建：带正电荷的釉质面促进骨的吸收破坏，带负电荷的牙骨质面促进成骨，加快细胞外基质的合成分泌，促进骨的形成与成熟。脉冲电磁场、高频电刺激均会对骨细胞的成骨功能产生影响。在脉冲电磁场作用下，人体躯干、髋部骨骼等表面或内部将产生生物物理刺激电磁场效应，提高骨密度。
2 成骨能力及其方式
2.1 存在的问题
Bensa?觙d等[8]发现，细胞在支架上的分布影响移植后的最终成骨能力，种子细胞限制在支架最外层较高密度分布于整个支架内的成骨能力强。Oest等[9]发现，骨首先形成于周边的支架，其次是比较有限的矿物沉积于支架内部。在生理性骨发育过程中，成骨细胞在骨小梁表面不断增长加粗形成骨松质，骨松质的外侧部分逐步改建为骨密质。在骨外膜中，骨祖细胞分化为成骨细胞，在骨干表面添加骨组织使骨干变粗。在骨干的内表面，破骨细胞吸收骨小梁使骨髓腔横向扩大。可见生理性骨的形成是由内向外逐步生长改建的，而组织工程骨与之相反。
2.2 问题的原因分析
2.2.1 组织工程骨的血管化 植入支架内部细胞的氧气与营养的供应是值得深入研究的问题[10]。种子细胞在缺乏足够的营养时，其代谢受到影响甚至死亡，造成成骨能力下降。充足的血供能将成骨前体细胞、相关信号分子、营养物质等大量携带到局部微环境中，并带走局部代谢产生的废物和坏死分解产物。此外Lee等[11]发现，血管化可能有助于微环境稳定并增加间质前体细胞在病灶临近的募集。大块组织工程骨如上下颌骨常有一定的直径和长度，植入体内后脱离了正常骨组织中血液提供的丰富营养，也脱离了体外可控的培养条件，依靠周围组织的血管长入存在速度慢和血供不足的问题。因此构建具有血管化的组织工程骨对支架内部的成骨能力具有十分重要的意义。
2.2.2 骨膜的构建 骨膜中含有成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞和血管内皮细胞，是骨生成与改建的主要细胞来源和骨膜成骨的基础。骨膜血管丰富，同时还合成转化生长因子-β、胰岛素样生长因子和骨形态发生蛋白-2等重要生长因子。构建带有骨膜的复杂组织工程骨会使其成骨能力及其方式有较大改进，但此项技术无疑还有很长的路要走。
3 组织工程化骨
3.1 存在的问题
组织工程骨与天然的生理性骨有较大差距：1）组织工程骨较患者自身移植骨的痊愈能力低[8]；2）功能性整合的出现被继续保留的缓慢降解的支架材料与诱导成骨信号的剂量或传递所限制[9]，不可吸收材料在试验最后阶段仍保留在骨缺损缝隙内，虽然能行使功能，但这种生物材料和骨的混合体不能完全重新建立骨整合[12]；3）组织工程骨不能完全替代病损的功能，特别是负重部位的功能替换，涉及生物力学，移植效果尚难确定；4）没有证据表明组织工程骨具有感觉功能；5）组织工程骨的自我改建能力低。
3.2 问题的原因分析
3.2.1 破骨细胞的引入 骨是一种动态性组织，它通过不断形成和吸收起到塑形和维持形态等作用。骨的改建是从骨吸收开始尔后骨形成。破骨细胞是骨吸收的必要条件，它必须通过征集和激活过程才能产生骨吸收并对骨的改建起作用。研究表明，破骨细胞缺乏会导致骨发育过程中骨基质排列紊乱、矿化缺陷、成骨细胞减少和成骨细胞行为异常，从而导致成骨细胞在骨形成表面的层状排列和向骨表面方向沉积骨基质的能力丧失。Dai等[13]研究发现，当把缺陷鼠的骨原基移植进入正常鼠的肾包囊下并形成嵌合体，由于有正常鼠向缺陷鼠骨原基提供破骨细胞，经过一段时间植入后，缺陷鼠的骨原基形成了正常的骨组织结构。他们认为，破骨细胞在骨发育中对成骨细胞骨形成具有重要的调节作用。Boyan等[14]发现，经过对骨片表面20 d的破骨细胞预处理，形成的骨钙、转化生长因子-β、地诺前列酮等较塑料和未经处理的骨片显著增加。目前，尚没有组织工程骨引入破骨细胞的报道，其引入可能会解决组织工程骨中存在的许多问题[15]。
3.2.2 组织工程骨的神经化 骨有复杂的自主神经和感觉神经支配，骨骼细胞中有某些神经肽受体，如神经肽Y、降钙素基因相关肽、血管活性肽和P物质。细的有髓神经纤维和无髓神经纤维与营养血管伴行进入骨和骨髓，并位于中央管（旧称哈弗管）的血管周围间隙内。正常骨组织中有广泛的肽能神经分布，尤其在成骨活动活跃区域，新生骨组织中神经支配的现象更为显著。
神经生长因子（nerve growth factor，NGF）除营养神经外，还参与骨折愈合的过程。研究发现，在正常骨组织和骨折的骨痂中有NGF及其受体的表达，同时局部给予外源性NGF对骨折愈合具有促进作用。在人长骨不连患者的局部组织中，存在神经纤维缺失的现象，而失神经支配可能是影响骨折正常愈合的原因之一。在截瘫和颅脑外伤伴四肢骨折的患者中，往往骨折的骨痂异常增大，甚至出现关节周围异位骨化现象。然而在动物失神经试验研究中，虽然骨痂形成加快且明显增大，但骨痂密度不规则，骨痂力学强度明显减弱。有研究证实，肽能神经具有抑制破骨细胞活性的作用，神经切断可导致抑制作用降低，从而致破骨细胞活性增高并导致骨质疏松[16]。破骨细胞过度活跃将导致骨小梁结构的改变。由于骨松质力学强度由骨量和骨结构共同决定，因此切除神经后所致破骨细胞活性的增强是导致骨密度不均匀、力学强度下降的原因。
【关键词】 骨组织工程； 血管化； 神经化
用组织工程学方法促进牙槽骨再生，以修复牙周疾病引起的牙周组织缺损是近年来的研究热点。骨组织工程是用少量的具有分化潜能的细胞，经体外培养扩增后用以修复大块骨组织缺损，同时依据缺损情况任意塑型，达到理想的形态修复，最终实现真正意义上的功能重建。但该项技术发展至今，沿着传统的思路来构建活体组织工程骨的研究遇到了挑战。下面就骨组织工程技术中存在的问题作为切入点，探讨其可能的原因，以探索骨组织工程技术研究的创新之路。
1 细胞培养
1.1 细胞培养存在的问题
培养的细胞在功能和行为上与体内的细胞有较大差异。主要表现为：1）培养的成骨细胞不能有组织地分泌胶原纤维和形成板层骨结构，不能以体内所见的方式沉积具有天然骨特征的骨矿
物[1]；2）从体内到体外时，细胞会发生行为变异与转型，即培养休克，这些培养细胞通常仅维持三代，表型漂移变得较明显[2]；3）长期培养的成骨细胞会丧失向骨面分泌骨基质的分泌极性，跨越细胞孔壁生长，阻碍支架内外代谢产物和营养物质的交换，造成组织在支架上的分布不均[3]；4）培养的骨髓基质干细胞逐渐失去增殖潜力[4]；5）随着培养时间的延长，细胞的生长速度放缓，从纺锤状变为较大的扁平形态，端粒长度下降，所有的迹象都显示出老龄化倾向，延长的体外扩增也影响骨髓基质干细胞的分化潜能[5]；6）培养的间充质干细胞存活率降低[6]。
1.2 问题的原因分析
影响培养细胞的因素除大家熟知的生物学微环境，如植入物的营养供给和诱导种子细胞增殖及定向分化的生物信息外，力学和电学因素也会对其造成影响。
1.2.1 力学微环境 成骨细胞、骨细胞等是力学敏感细胞。骨组织丧失重力负荷或肌肉收缩的刺激会使骨组织产生变形或微损害，骨代谢遭受破坏。研究发现，载荷首先使成骨细胞发生分化，进而诱导骨基质沉积。由于人体细胞是在机体提供的微动力学环境中生长的，在体外采用传统的细胞培养方式和条件很难满足立体组织器官的细胞生长要求，细胞经常发生去分化现象，失去正常的形态与功能。目前有关应力对分泌纤维的成分、分布与排列即组织形成的影响研究尚少，而这恰好是自身组织形成的必要前提。因此，研究模拟体内生理条件下组织生长的微动力学培养环境、应力与生长的关系对组织工程有着非常重要的意义。
1.2.2 电学微环境 骨组织亦有电生理特性，其代谢活动和机械形变能够产生直流电和交变电场，外来电场也可影响骨骼的生长与改建。外来电场的负极能诱导成骨细胞的形成与分化，可缩短骨不连、骨折患者的愈合时间。破骨细胞同样也受电磁场的影响。张加理等[7]发现，牙体硬组织表面电位可影响骨改建：带正电荷的釉质面促进骨的吸收破坏，带负电荷的牙骨质面促进成骨，加快细胞外基质的合成分泌，促进骨的形成与成熟。脉冲电磁场、高频电刺激均会对骨细胞的成骨功能产生影响。在脉冲电磁场作用下，人体躯干、髋部骨骼等表面或内部将产生生物物理刺激电磁场效应，提高骨密度。
2 成骨能力及其方式
2.1 存在的问题
Bensa?觙d等[8]发现，细胞在支架上的分布影响移植后的最终成骨能力，种子细胞限制在支架最外层较高密度分布于整个支架内的成骨能力强。Oest等[9]发现，骨首先形成于周边的支架，其次是比较有限的矿物沉积于支架内部。在生理性骨发育过程中，成骨细胞在骨小梁表面不断增长加粗形成骨松质，骨松质的外侧部分逐步改建为骨密质。在骨外膜中，骨祖细胞分化为成骨细胞，在骨干表面添加骨组织使骨干变粗。在骨干的内表面，破骨细胞吸收骨小梁使骨髓腔横向扩大。可见生理性骨的形成是由内向外逐步生长改建的，而组织工程骨与之相反。
2.2 问题的原因分析
2.2.1 组织工程骨的血管化 植入支架内部细胞的氧气与营养的供应是值得深入研究的问题[10]。种子细胞在缺乏足够的营养时，其代谢受到影响甚至死亡，造成成骨能力下降。充足的血供能将成骨前体细胞、相关信号分子、营养物质等大量携带到局部微环境中，并带走局部代谢产生的废物和坏死分解产物。此外Lee等[11]发现，血管化可能有助于微环境稳定并增加间质前体细胞在病灶临近的募集。大块组织工程骨如上下颌骨常有一定的直径和长度，植入体内后脱离了正常骨组织中血液提供的丰富营养，也脱离了体外可控的培养条件，依靠周围组织的血管长入存在速度慢和血供不足的问题。因此构建具有血管化的组织工程骨对支架内部的成骨能力具有十分重要的意义。
2.2.2 骨膜的构建 骨膜中含有成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞和血管内皮细胞，是骨生成与改建的主要细胞来源和骨膜成骨的基础。骨膜血管丰富，同时还合成转化生长因子-β、胰岛素样生长因子和骨形态发生蛋白-2等重要生长因子。构建带有骨膜的复杂组织工程骨会使其成骨能力及其方式有较大改进，但此项技术无疑还有很长的路要走。
3 组织工程化骨
3.1 存在的问题
组织工程骨与天然的生理性骨有较大差距：1）组织工程骨较患者自身移植骨的痊愈能力低[8]；2）功能性整合的出现被继续保留的缓慢降解的支架材料与诱导成骨信号的剂量或传递所限制[9]，不可吸收材料在试验最后阶段仍保留在骨缺损缝隙内，虽然能行使功能，但这种生物材料和骨的混合体不能完全重新建立骨整合[12]；3）组织工程骨不能完全替代病损的功能，特别是负重部位的功能替换，涉及生物力学，移植效果尚难确定；4）没有证据表明组织工程骨具有感觉功能；5）组织工程骨的自我改建能力低。
3.2 问题的原因分析
3.2.1 破骨细胞的引入 骨是一种动态性组织，它通过不断形成和吸收起到塑形和维持形态等作用。骨的改建是从骨吸收开始尔后骨形成。破骨细胞是骨吸收的必要条件，它必须通过征集和激活过程才能产生骨吸收并对骨的改建起作用。研究表明，破骨细胞缺乏会导致骨发育过程中骨基质排列紊乱、矿化缺陷、成骨细胞减少和成骨细胞行为异常，从而导致成骨细胞在骨形成表面的层状排列和向骨表面方向沉积骨基质的能力丧失。Dai等[13]研究发现，当把缺陷鼠的骨原基移植进入正常鼠的肾包囊下并形成嵌合体，由于有正常鼠向缺陷鼠骨原基提供破骨细胞，经过一段时间植入后，缺陷鼠的骨原基形成了正常的骨组织结构。他们认为，破骨细胞在骨发育中对成骨细胞骨形成具有重要的调节作用。Boyan等[14]发现，经过对骨片表面20 d的破骨细胞预处理，形成的骨钙、转化生长因子-β、地诺前列酮等较塑料和未经处理的骨片显著增加。目前，尚没有组织工程骨引入破骨细胞的报道，其引入可能会解决组织工程骨中存在的许多问题[15]。
3.2.2 组织工程骨的神经化 骨有复杂的自主神经和感觉神经支配，骨骼细胞中有某些神经肽受体，如神经肽Y、降钙素基因相关肽、血管活性肽和P物质。细的有髓神经纤维和无髓神经纤维与营养血管伴行进入骨和骨髓，并位于中央管（旧称哈弗管）的血管周围间隙内。正常骨组织中有广泛的肽能神经分布，尤其在成骨活动活跃区域，新生骨组织中神经支配的现象更为显著。
神经生长因子（nerve growth factor，NGF）除营养神经外，还参与骨折愈合的过程。研究发现，在正常骨组织和骨折的骨痂中有NGF及其受体的表达，同时局部给予外源性NGF对骨折愈合具有促进作用。在人长骨不连患者的局部组织中，存在神经纤维缺失的现象，而失神经支配可能是影响骨折正常愈合的原因之一。在截瘫和颅脑外伤伴四肢骨折的患者中，往往骨折的骨痂异常增大，甚至出现关节周围异位骨化现象。然而在动物失神经试验研究中，虽然骨痂形成加快且明显增大，但骨痂密度不规则，骨痂力学强度明显减弱。有研究证实，肽能神经具有抑制破骨细胞活性的作用，神经切断可导致抑制作用降低，从而致破骨细胞活性增高并导致骨质疏松[16]。破骨细胞过度活跃将导致骨小梁结构的改变。由于骨松质力学强度由骨量和骨结构共同决定，因此切除神经后所致破骨细胞活性的增强是导致骨密度不均匀、力学强度下降的原因。